生物色谱用于中药活性成分筛选

ApplicationofBiochromatographyinScreeningtheBioactiveComponentsfrom

TraditionalChineseMedicine

周思维，邱瑞琪，高彩芳，陆伟根*

(中国医药工业研究总院药物制剂国家工程研究中心，上海)

摘要：生物色谱是基于受体药理学、细胞生物学、液相色谱技术等原理，以生物活性材料为固定相配基的新型色谱技术，其特点在于能够反映待测物的生理学及药效学作用。该色谱技术用于中药活性成分筛选具有高通量、特异性较强、分离筛选相结合等优势，并为研究药物与受体相互作用、蛋白质的分离提纯及中药质量控制等提供了新的方法。本文介绍了固定化脂质体色谱、细胞膜色谱、分子生物色谱等在中药活性成分筛选领域中的应用。

关键词：生物色谱；固定化脂质体色谱；细胞膜色谱；分子生物色谱

以下为文章节选

生物色谱(biochromatography)是将受体、载体蛋白、细胞膜等生物活性材料与载体结合作为固定相，利用生物活性物质间特异性结合的原理，结合液相色谱技术特点的新型色谱技术。传统色谱技术对待测物的筛选分离是基于理化特性，虽然分离效能较高，但无法给出待测成分中与生物活性相关的信息。而生物色谱的固定相配基是具有生物活性的物质，因此待测物通过疏水力、范德华力、静电作用等与固定相配基特异性结合，筛选分离出活性物质且测得的表达参数在一定程度上能够反映待测物的生理学与药效学意义[1]。

与成分明确的化学药物相比，中药构成更为复杂。单味中药材中含有大量的未知成分，复方中药所含组分则更多，还存在组合药效[2]。因此，从中药材中筛选活性成分并明确其作用机制是一项重大挑战。生物色谱技术能够消除无活性成分对分析结果的干扰，缩小筛选范围，同时与高效液相色谱、质谱等联用还能对有效成分进行结构鉴定，为中药筛选工作提供了简便有效的方法。根据固定相种类的不同，本文介绍几种较为常用的生物色谱技术。

1固定化脂质体色谱用于中药活性筛选

固定化脂质体色谱法(immobilizedliposomechromatography，ILC)是将脂质体结合到硅胶载体表面制成固定相，利用液相色谱学技术研究流动相中待测物与脂质体相互作用的新型色谱法。脂质体固定化的方法主要有：冻融法、冻干再水化、反向蒸发、疏水吸附、渗析吸附等[3]。Liu等研发出了利用抗生物素蛋白-生物素亲和单泡脂质体作为固定相[4]，用氯甲酸酯活化孔径较大的凝胶作为载体的脂质体色谱柱，这种色谱柱具有更好的稳定性，

且对待测物干扰较小。

脂质体是由磷脂制成的微球，具有与生物膜类似的磷脂双分子层结构，活性成分在ILC上的色谱保留可以模拟其与生物膜的相互作用，反映活性成分在细胞膜上的穿透能力，研究表明，药物在ILC色谱柱上测得的膜分配系数(logK)与在Caco-2模型上测定的膜渗透系数(logPc)有较好的相关性(r=0.)[5]。因此，ILC可作为研究药物跨膜吸收、口服药物生物利用度以及蛋白质分离纯化等方面的模型[6—8]。

1.1一维脂质体色谱

药物活性成分在ILC上的分离机制在于与磷脂双分子层间的相互作用，保留时间越长，说明与膜的作用力越强，该活性成分则更易透过细胞膜[9]。韩欢利用ILC对决明子及天麻中的活性成分进行了筛选分析[10]，结果显示，决明子乙醇提取物中至少含有7种活性成分，天麻乙醇提取液中至少含有3种活性成分。通过与对照品比对可知，决明子提取液中3种活性成分为芦荟大黄素、大黄素及大黄酚；天麻提取液中1种活性成分为天麻素。决明子中的芦荟大黄素、大黄酚及大黄素保留时间较长，推测透膜吸收能力强；天麻中的天麻素保留时间仅1.92min，推测透膜吸收能力较弱。

1.2二维脂质体色谱

Wang等以脂质体色谱柱为第一维色谱柱[12]，硅胶整体柱(整体柱是由单体、引发剂、致孔剂等混合物在色谱柱内通过原位热引发或光引发聚合而成的一个棒状整体)为第二维色谱柱，建立了全二维高效液相色谱，用于研究北五味子中的活性成分。经检测，北五味子中含有40种以上的活性成分，通过紫外图谱及电喷雾电离质谱(ESI-MS)鉴定，14种组分结构均得到确证。该试验中还采用主成分分析(PCA)及分层聚类分析(HCA)的统计方法，可以对不同产地的五味子进行质量控制。可见，全二维液相色谱串联质谱的方法可用于中药活性物质筛选及道地药材鉴别。

1.3优势与不足

固定化脂质体色谱具有以下优势：脂质体与细胞膜结构相似，能较好地模拟待测物与生物膜间的相互作用；与其他色谱联用构成二维生物色谱提高了分辨能力与峰容量，缩短了分析时间[14]。但也存在如下问题：ILC分离能力目前仍不如HPLC；ILC上无载体蛋白，仅能筛选出被动吸收的药物，经主动吸收途径吸收的药物在色谱柱上无保留[15]。

2细胞膜色谱在中药筛选中的应用

细胞膜色谱(cellmembranechromatography，CMC)是将生物细胞膜或整个细胞固定在特定载体上作为固定相，结合了液相色谱技术、受体药理学等理论，用于研究药物与生物膜之间的亲和性，以及筛选目标化合物的新型色谱技术。利用载体表面活性基团与生物膜之间的不可逆吸附作用以及细胞膜的融合作用制备细胞膜色谱柱。现代药理学研究表明，药物起效的关键在于与细胞膜上的受体、通道或酶相结合[16]。因此，药物的细胞膜通透性对其生物活性非常重要。中药待测物通过与细胞膜色谱柱上的自然细胞或受体高表达细胞相互作用，能够达到活性物质筛选以及明确中药有效成分作用的受体类型的目的。

2.1自然细胞为固定相配基

不同种类的细胞具有不同的作用靶点，因此中药活性成分的药理效应不同，选择作为固定相配基的细胞也不尽相同。例如，选择牙周膜细胞作为固定相配基筛选治疗牙周炎的中药活性成分[17]；选择心肌细胞筛选治疗心血管疾病的活性成分[18]；选取肾小球系膜细胞筛选治疗肾病的活性成分等[19]。

2.2受体高表达细胞为固定相配基

自然细胞膜上的蛋白质种类较多，待测物可能与多种受体相互作用，因此使用自然细胞膜作为固定相进行试验易受非特异性结合因素的干扰。利用现代分子生物学手段，研究者构建了受体高表达的CMC模型。王新等将β1肾上腺素受体(β1-AR)细胞膜色谱与UPLC/MS联用[22]，研究夏天无中与β1-AR作用的活性成分及其对该受体的抑制作用。夏天无提取液在CMC上有明显保留行为，经UPLC/MS鉴定该保留组分为药根碱。结合细胞试验进一步研究了药根碱对β1-AR的抑制作用，结果表明药根碱可以降低细胞中环磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)水平，对β1-AR有拮抗作用。

2.3优势与不足

CMC无需分离提取步骤，药物可直接在CMC模型上筛选活性成分，操作简便快速[24]；可用于预测中药有效成分作用的受体，且测定的结果与传统方法(如放射性配体结合试验)结果具有显著相关性[25—27]；高表达细胞作为CMC的固定相能够增加特定受体的表达量，对受体类型具有可控性。但也存在以下缺点：流动相的选择不仅要考虑被测物的理化性质，还要考虑固定相上细胞膜的耐受性，因此CMC适用的药物种类有限；CMC的洗脱液中无机盐浓度较高，无法直接与质谱联用，需要以HPLC为媒介，因此实验操作步骤较复杂。

3分子生物色谱

分子生物色谱(molecularbiochromatography，MBC)是将受体、血浆运输蛋白、酶、DNA等具有生理功能的生物大分子与载体结合作为固定相，利用分子特异性识别原理，研究生物分子相互作用的新型色谱技术。生物大分子通过吸附蛋白法、含间隔臂键和蛋白法以及不含间隔臂键和蛋白法等固定在载体上[28]。

3.1血清白蛋白分子生物色谱用于中药筛选

药物进入血液后能与血清蛋白、α1-酸性糖蛋白等发生可逆性结合，然而只有游离型药物才能与活性位点结合引发药效[29]。因此，研究能与血浆蛋白相互作用的活性成分对了解药物在体内的药动学行为具有重要意义。潘再法等采用牛血清白蛋白(BSA)分子生物色谱-气相色谱(GC)-质谱(MS)联用的方法测定当归中的活性成分[30]。当归甲醇提取液经分子生物色谱初筛后，保留组分使用GC-MS分离鉴定，共测得藁本内酯等8种活性成分。

3.2脂筏色谱

3.2.1单靶点抗肿瘤活性成分筛选

脂筏是细胞膜磷脂双分子层中含有特殊脂质和蛋白质的区域，与细胞内信号转导、物质转运等功能有关。将从肿瘤细胞中提取的脂筏用于肿瘤治疗成为新的研究热点[32]。脂筏色谱是以脂筏作为固定相配基，结合高效液相色谱、受体药理学与分子生物学等原理，利用药物与脂筏中特异受体间的亲和力筛选分离所需组分的新方法。Tong等从脑胶质瘤细胞U细胞中提取脂筏[33]，其中含有酪氨酸蛋白激酶受体(TrkA)，以此作为固定相配基建立TrkA脂筏色谱，用于研究中药五倍子中的抗肿瘤活性成分。五倍子不同极性溶剂的萃取物经TrkA脂筏色谱分离后，仅五倍子乙醚萃取物在色谱上有保留行为，保留组分经NMR检测鉴定为没食子酸和没食子酸乙酯。进一步通过四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)证明经脂筏色谱筛选出的保留组分具有较好的肿瘤细胞抑制效果。

3.2.2多靶点抗肿瘤活性成分筛选

目前中药抗肿瘤活性成分的筛选多为单靶点筛选模式，然而药物活性成分大多通过多靶点多途径发挥治疗作用，因此多组分多靶点活性成分筛选模式的开发将成为主流。屈睿从乳腺癌MCF-7细胞株中提取了富含表皮生长因子(EGFR)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)及凋亡相关蛋白因子(Fas)的脂筏建立了多靶点脂筏色谱[34]，研究北葶苈子中抗肿瘤的活性成分。北葶苈子的不同极性溶剂萃取液经脂筏色谱筛选后，仅北葶苈子水饱和正丁醇萃取部位具有保留行为。该活性部位经MTT法考察后，表明北葶苈子水饱和正丁醇萃取部位对4种肿瘤细胞株均具有抑制作用。该脂筏色谱实现了对中药活性成分多靶点高效在线筛选，改变了中药单靶点筛选的现状。

3.3优势与不足

以血清白蛋白为固定相的分子生物色谱可以测定待测物与血清白蛋白间的相互作用，为血浆结合率提供参考数据[35]。脂筏色谱具有较强特异性，无需专门培养受体高表达细胞，且寿命较细胞膜生物色谱要长的优点[36]。但也存在如下问题：分离能力较差；色谱柱专一性强，不能用于多类物质的分离；易产生不可逆吸附，分离过程慢等。

4结语

通过上述介绍，生物色谱用于中药活性成分筛选的总体实验思路可总结如下：首先依据实验目的选择特定生物活性物质作为固定相配基；进样后，根据待测物在生物膜色谱上是否具有膜透性，或在分子生物色谱上是否对特定受体具有选择性，筛选出所需活性物质；最后与HPLC、NMR、MS等联用对筛选出的活性成分进行结构鉴定，从而实现中药活性物质的筛选、分离、鉴定一体化。虽然生物色谱技术具有无需对样品分离纯化、能够反映药理学特性、特异性较强等优点，但也存在制备成本高、色谱柱使用寿命较短、难以实现商品化、无法模拟体内复杂的代谢环境致使活性成分筛选不全面等问题[37]。随着后续研究的深入开展，生物色谱在中药活性成分筛选领域将拥有更广阔的应用空间。

作者简介：周思维(—)，女，硕士研究生，专业方向：新型药物制剂。

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